A new method of molecular diagnosis for the Huntington’s disease via PCR

Abstract

[EN] Single gene disorders are the most studied genetic diseases due to its simple inheritance pattern (recessive or dominant). Huntington’s disease (HD) is a single gene disorder which appears between the third and fifth decade of life. It is a progressive neurodegenerative disorder, which leads to 15-20 years of life expectancy after the first symptoms appear. Due to the late onset of the disease, an early diagnosis can be crucial, that is why an easy and cheap method of diagnosis is important. The disease is caused by the number of (CAG)n repeats in the huntingtin (Htt) gene; people with over 36 CAG repeats can develop the disorder. Previous molecular diagnosis had been developed, but were expensive or unsuitable for routine use. In this study, we developed a new, cheap and easy method to detect Huntington´s disease via PCR (polymerase chain reaction). To develop the new method, we tested specific primers in positive and negative control samples to verify the effectiveness. We tested the best concentrations of the reagents and conditions for the PCR. Due to the high concentration of the bases C and G, secondary structures were formed in the DNA chain in the amplicon, we used betaine for the disruption of this secondary structures. To measure the exact number of CAG repeats we made a semilogarithmic regression and used its equation. Results showed that the developed method was effective for the detection of the Huntington’s disease in positive and negative controls. With the developed method, we were able to perform the molecular diagnosis of an unknown individual with chances of developing the disease. Taken together, we have developed a new method of molecular diagnosis for the Huntington´s disease via PCR.

[ES] Los trastornos monogénicos son las enfermedades genéticas más estudiadas debido a su simple modelo de herencia (dominante o recesivo). La enfermedad de Huntington (HD) es un trastorno monogénico que aparece entre la tercera y quinta década de vida. Es una enfermedad progresiva y neurodegenerativa, que lleva a 15-20 años de esperanza de vida después de que los primeros síntomas aparezcan. Debido a la tardía expresión de la enfermedad, un diagnóstico temprano es crucial, es por ello que un diagnóstico barato y sencillo es tan 4 importante. La enfermedad depende de las repeticiones de (CAG)n en el gen de la huntingtina (Htt); las personas con más de 36 copias de CAG pueden desarrollar la enfermedad. Anteriormente se han desarrollado diagnósticos moleculares pero eran caros o inadecuados para el uso rutinario. En este estudio hemos desarrollado nuevo, barato y fácil método para detectar la enfermedad de Huntington vía PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Para desarrollar este nuevo método, hemos testado unos primers específicos en controles positivos y negativos para verificar la efectividad. Hemos testado las mejores concentraciones de los reactivos y las condiciones de la PCR. Debido a la gran concentración de bases C y G, se formaron estructuras secundarias en la cadena de ADN del amplicón, utilizamos betaína para deshacer esas estructuras secundarias. Para medir el número exacto de repeticiones de CAG, hicimos una regresión semilogarítmica y usamos la ecuación de esta regresión. Los resultados mostraron que el método desarrollado para detectar la enfermedad de Huntington era efectivo, tanto en controles positivos como negativos. Con el método desarrollado, fuimos capaces de hacer el diagnóstico molecular de un individuo con probabilidades de desarrollar la enfermedad. Resumiendo, hemos creado un método nuevo de diagnóstico molecular para detectar la enfermedad de Huntington vía PCR.