Proteostasis and Rare Diseases: Congenital Erythropoietic Porphyria and Townes-Brocks Syndrome

Abstract

El término proteostasis se refiere a todos aquellos procesos biológicos críticos para el buen funcionamiento de la célula. La alteración de las vías reguladoras de la proteostasis puede afectar seriamente la función celular y causar la aparición de enfermedades, incluidas enfermedades raras como el Síndrome de Townes-Brocks (TBS) y la Porfiria Eritropoyética Congénita (CEP).La CEP es causada por una deficiencia en la cuarta enzima de la vía de producción del grupo hemo, UROS. El alelo patógeno más común, C73R, genera una proteína inestable con menos del 1% de la actividad normal, lo que conduce a la acumulación de porfirinas y a fenotipos graves. El modelo clásico de ratón C73R tiene poca viabilidad y presenta problemas de salud crónicos, lo que plantea desafíos para su uso experimental. Para generar un modelo de ratón humanizado, inducible, mutante para CEP, diseñamos un nuevo interruptor genético de inserción única para reemplazar el alelo Uros del ratón con una versión controlada condicionalmente. El UROS humano reemplaza y rescata la función UROS del ratón y, tras la inducción con tamoxifeno de la recombinasa Cre, el alelo expresa la versión mutante C73R. Para verificar su funcionalidad, se testó el sistema en fibroblastos murinos. Se usó CRISPR/Cas9para introducir la construcción en las células. El correcto funcionamiento del sistema fue validado tanto a nivel de ADN como de proteína. Se realizaron análisis FACS y HPLC para medir los niveles de porfirinas e investigar la actividad de UROS. Este modelo celular, así como el modelo de ratón knock-in planificado, serán herramientas novedosas para permitir estudios más profundos en CEP y probar posibles terapias.El TBS está causado por mutaciones en el represor transcripcional de dedos de zinc SALL1 y se caracteriza por un espectro de malformaciones en dígitos, oídos y riñones. Para dilucidar las funciones y la regulación de SALL1 en el contexto de las modificaciones postraduccionales, se utilizó un ensayo de proteómica de proximidad BioID en combinación con espectrometría de masas para identificar posibles interactores de SALL1 humano. Entre éstos, encontramos CBX4, una E3 SUMO ligasa y un miembro clave del Complejo Polycomb 1 de Represión involucrado en la remodelación de la cromatina y el silenciamiento génico. Confirmamos que SALL1 y CBX4 interactúan entre sí a nivel de proteína y que colocalizan en el nucleoplasma. Al modificar su ubiquitinación y su posterior degradación a través del proteasoma, SALL1 estabiliza y aumenta los niveles de proteína de CBX4, afectando así la formación de cuerpos nucleares Pc que parecen más abundantes y más grandes. Además, altos niveles de SALL1 aumentan la capacidad de represión transcripcional de CBX4 en algunos de sus genes diana. Curiosamente, la SUMOilación de SALL1 parece ser necesaria para mejorar el efecto de represión transcripcional de CBX4. Elucidar la relación subyacente a la interacción entre SALL1 y CBX4, podría ayudar a comprender mejor el papel de SALL1 durante el desarrollo normal y en la patogénesis de TBS.En conjunto, los resultados obtenidos a lo largo de este trabajo podrían ayudar a comprender mejor la patogénesis de estas dos enfermedades raras y podrían ayudar en el avance del desarrollo de potenciales.