Autophagy and phagocytosis: functional relationship in microglia.

Abstract

La microglía es el macrófago del cerebro, en constante vigilancia del parénquima cerebral para garantizar el mantenimiento de la homeostasis tisular. La microglía es ampliamente conocida por supapel como mediadora de la inflamación y la eliminación de material extracelular a través de la fagocitosis. Nuestro laboratorio esta interesado en la eliminación de células apoptóticas, tanto en fisiología como en patología; un proceso esencial para evitar el vertido del contenido citotóxico que resulta de la muerte celular y limitar así la inflamación debida a la fuga de moléculas tóxicas. Además de la fagocitosis, otro proceso esencial orientado a la preservación de la homeostasis tisular a través del reciclaje de componentes propios es la autofagia. Nuestro interés principal reside en la macroautofagia(autofagia de ahora en adelante), a través de la cual, la célula, puede reciclar múltiples macromoléculas,como proteínas, además de orgánulos dañados o envejecidos, como mitocondrias. Ambos fagocitosis yautofagia son procesos altamente conservados orientados al reciclaje de componentes extracelulares opropios, respectivamente, para mantener la homeostasis tisular además de ser parte del sistema endosomal, que converge en el lisosoma. En esta Tesis Doctoral hemos querido responder a unapregunta principal: ¿cuál es la relación funcional entre autofagia y fagocitosis? Para ello, hemos estudiado el papel de la fagocitosis y la autofagia microgliales en un modelo in vitro de isquemia cerebral, además, hemos propuesto una nueva aproximación para analizar la autofagia usando el clásico ensayo de western blot, y hemos analizado la fagocitosis microglial en un modelo de epilepsia genética.Resultados previos del laboratorio, usando un modelo in vivo de oclusión de la arteria cerebral media(tMCAo), observamos que la fagocitosis estaba bloqueada. Primero determinamos los mecanismos subyacentes a la ausencia de oxígeno y nutrientes (OND) en dos modelos in vitro de cultivo organotípco de hipocampo y microglía primaria. La fagocitosis microglial estaba bloqueada después de la privación pero era rápidamente recuperada después de la reperfusión. Usando microscopía de doble fotón observamos que la motilidad de los procesos microgliales estaba reducida, evitando el reconocimientode los cuerpos apoptóticos. En microglía primaria la OND bloqueó la degradación, pero no enenglobamiento, de los cuerpos apoptóticos acompañado de basificación del compartimento lisosomal acausa de la OND, así como una reducción en su número y tamaño. Las alteraciones en lisosoma nosllevaron a analizar los posibles cambios en la cascada autofágica, sin embargo, no detectamos cambiosLC3-II, probablemente debido a la limitada sensibilidad de la técnica. Por otra parte, si observamos un incremento en el número de vesículas autofágicas y el área que ocupaban mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Estos descubrimientos desentrañaron in bloqueo tanto en elenglobamiento como en la degradación de células apoptóticas, probablemente debido a las alteraciones en el compartimento lisosomal y a la inducción de una respuesta autofágica. Así mismo,analizamos el papel de la autofagia basal en la microglía usando tres modelos in vivo de deficiencia deautofagia y determinamos que la autofagia era necesaria para mantener la función fagocítica de lamicroglía y su supervivencia. Confirmamos dichos resultados in vitro usando inhibidor selectivo de laenzima ULK1, MRT68921, que indujo una reducción en la supervivencia y fagocitosis microgliales.Por otra parte, datos previos del laboratorio empleando el modelo de isquemia tMCAo, demostraronque la administración de la inductora de autofagia rapamicina, recobró parcialmente la fagocitosis microglial después de la isquemia. Nuestra próxima aproximación fue testar el efecto de la rapamicina en la autofagia y en la fagocitosis microgliales; sin embargo, no tuvo efectos detectables sobre la autofagia en condiciones basales ni tras la OND, analizada por western blot. La rapamicina no recobró la fagocitosis en cultivos organotípicos de hipocampo ni en microglía primaria. Por lo tanto, a pesar de serun compuesto beneficioso para recuperar la fagocitosis in vivo, la rapamicina no revirtió el bloqueo dela fagocitosis observado in vitro y no indujo cambio sobre la autofagia, al menos tras su análisis mediante western blot.Para profundizar en el análisis de western blot, propusimos una serie de ecuaciones sencillas paracalcular tanto la formación como la degradación, considerando la autofagia como un proceso con una entrada, formación de nuevos autofagosomas, y una salida, degradación de autofagosomas. La distinción entre formación y degradación y la adición del término ratio neto de cambio (net turnoverratio, formación/degradación) nos permitió discriminar los efectos de drogas específicas, que podrían actuar de forma diferente sobre formación y degradación.Finalmente, estudiamos la fagocitosis microglial en un modelo genético de epilepsia, la epilepsiamioclónica progresiva tipo I (EPM1), una enfermedad genética de inicio temprano en la que el gen quecodifica para la cistatina B (cstb) está mutado y da lugar a una proteína no funcional, un exceso deproteólisis, muerte celular y daño tisular. La fagocitosis microglial estaba bloqueada en ratones sintomáticos y confirmamos su bloqueo en ratones pre-sintomáticos. En primer lugar, a ausencia de CSTB exclusivamente en microglía, analizada usando un modelo de silenciamiento con siRNA enmicroglia BV2, no afectó a su capacidad fagocítica. Sin embargo pudimos derminar que el bloqueo de lafagocitosis observado in vivo se debió a la estrecha proximidad entre neuronas activas (cFOS+) y los cuerpos apoptóticos. El bloqueo de la fagocitosis microglial no se debía a una activación global del circuito ni a la ausencia de Cstb por sí misma, sino a un fenómeno local más complejo.